如果对生物安全柜子使用不当，其保护作用就会大大的打折扣。操作人员的手臂在伸出伸进安全柜时，需要小心别破坏安全柜前开口气流的完整性，要以垂直于安全柜的方向伸进或伸出。将手臂伸进安全柜后，要停留约1分钟，给安全柜时间调整其气流复位，并对手臂表面进行“吹扫”。柜内工作所需要的所有东西，应该在工作开始之前就全部放入柜内，这样可以使穿过柜前开口处的次数保持最低，同时可以使深圳厂房装修的效果最佳。
二级生物安全柜前的进气口绝对不能被纸张、设备等物品所阻挡。放置在柜内的材料表面，要以70%的酒精消毒。工作可以在浸有消毒液的毛巾上进行，以吸收泼溅出来的物质，所有的材料，只要不挡住后口，尽量在靠近工作表面后边缘处放置。可产生气溶胶的装置，像混合器、离心机等，应该朝柜内的一侧。工作要从工作表面的清洁区向污染区推进。
可进行压力熏蒸的生物危险储物袋、滴盘、盛抽吸物的烧瓶等，不能放置在柜外。带有这些容器的频繁的进出动作会破坏安全柜空气屏障的完整性，也大大降低了人员和产生的保护作用。
